Разглядеть замороженные молекулы

Разглядеть замороженные молекулы

Нобелевская премия 2017 года по химии была разделена между тремя исследователями. Швейцарец Жак Дюбоше (Jacques Dubochet) из Лозаннского университета, уроженец Германии Йоахим Франк (Joachim Frank), работающий сейчас в Колумбийском университете в Нью-Йорке, и Ричард Хендерсон (Richard Henderson) из Лаборатории молекулярной биологии Совета по медицинским исследованиям Великобритании в Кембридже получили премию за «разработку криоэлектронной микроскопии для исследования в высоком разрешении биологических молекул в растворах».

Криоэлектронная микроскопия становится все более популярной в исследованиях по молекулярной биологии, так как в ней не применяется обработка исследуемого препарата химическими фиксаторами, которые вносят искажения в его структуру. Вместо это препарат подвергается быстрой заморозке в жидком азоте, и его тонкая пленка просвечивается электронным микроскопом. При этом сохраняется пространственная структура исследуемых объектов.

До середины XX века ученые, понимая важную роль белков, ДНК и РНК в организме, ничего не могли сказать о строении этих молекул, а значит, не могли и объяснить, как именно они работают. Биохимики могли определить атомарный состав сложной молекулы, но не то, как соединены эти атомы. Первый прорыв этой области произошел 1950-х годах с появлением рентгеноструктурного анализа, в котором дифракция рентгеновских лучей на кристаллической решетке использовалась для определения пространственной структуры молекулы. В частности, именно эксперименты с рентгеновской дифракцией ДНК, проведенные Морисом Уилкинсом и Розалинд Франклин, предоставили необходимые данные для создания Френсисом Криком и Джеймсом Уотсоном в 1953 году модели двойной спирали ДНК.

В 1980-е годы возникла ЯМР-спектроскопия (спектроскопия ядерного магнитного резонанса). Само явление ядерного магнитного резонаса было известно с 1930-х годов. Оно состоит в том, что атомы в сильном постоянном магнитном поле с наложенным на него слабым переменным электромагнитным полем, поглощают или испускают электромагнитную энергию на определенной частоте. Она зависит как от самого атома, так и от того, какими атомами он окружен. Поэтому, регистрируя резонансные частоты исследуемого образца, можно определить, из каких атомов состоит молекула, каким образом они соединены между собой и каковы расстояния между ними. Преимущество ЯМР-спектроскопии состоит в том, что белковые молекулы можно исследовать в растворе, а не в кристаллическом состоянии, как при рентгеноструктурном анализе. В 2002 году швейцарец Курт Вюртрих получил Нобелевскую премию по химии «за разработку применения ЯМР-спектроскопии для определения трехмерной структуры биологических макромолекул в растворе».

Рентгеноструктурный анализ и ЯМР-спектроскопия позволили изучить строение тысяч биологических молекул. Но каждый из этих методов имеет свои ограничения. ЯМР-спектроскопия позволяет изучать белки в растворе, но реально рассчитать структуру по ее данным можно только для относительно небольших молекул. При рентгеновской кристаллографии, как уже говорилось, исследуется кристаллическая форма белка, а получить ее часто бывает сложно, а то и невозможно. К тому же застывшая кристаллическая структура не дает информации о динамических процессах. Ричард Хендерсон, работая в 1970-е годы в Кембриджском университете, столкнулся с еще одним ограничением рентгеноструктурного анализа. Он не дает возможности изучить молекулы белка, встроенные в мембраны, а, если эти белки извлечь из мембран, они слипаются в бесполезную массу. Потерпев неудачу с одним из мембранных белков, Хендерсон решил обратиться к электронной микроскопии. Но и тут все было не так просто. Разрешающая способность электронных микроскопов не всегда была достаточной, чтобы получить структуру на атомарном уровне. К тому же для электронной микроскопии исследуемых образец должен находиться в вакууме, а тогда вода из него испаряется и это ведет к нарушению естественной структуры белков.

Хендерсон иследовал бактериородопсин – светочувствительный мембранный белок, встречающий у организмов из царства архей (в то время их еще относили к бактериям). Под действием фотона света этот белок меняет свою структуру, перенося протон внутрь цитоплазмы, тем самым энергия солнечного света преобразуется в энергию разности электрических потенциалов на мембране, а она потом запасается в виде энергии химических связей АТФ. То есть при помощи бактериородопсина микроорганизмы осуществляют фотосинтез, подобно тому, как растения делают это при помощи хлорофилла.

Решив использовать электронный микроскоп, Ричард Хендерсон и его коллега Найджел Анвин (Nigel Unwin) не стали выделять молекулы бактериородопсина, а поместили в микроскоп фрагмент мембраны. Чтобы сохранить образцы, они заменили воду раствором глюкозы, а также снизили интенсивность потока электронов. Разрешение от этого уменьшилось, но Хендерсон и Анвин проанализировали дифракцию электронных лучей на белке, применив те же математические методы, что ранее использовались ими в рентгеноструктурном анализе. Затем они исследовали мембрану с бактериородопсином в электронном микроскопе в разных ракурсах и в итоге создали пространственную картину мембраны и размещения в ней белковой молекулы.

Первая трехмерная модель бактериородопсина, опубликованная Анвином и Хендерсоном в 1975 году в журнале Nature.

На тот момент это была лучшая картина белка, полученная электронным микроскопом. Разрешение составило 7 ангстрем (0,0000007 миллиметров). Но Хендерсон был уверен, что электронная микроскопия позволит достичь разрешения сравнимого с рентгеноструктурным анализом (3 ангстрема).

В последующие два десятилетия разрешающая способность электронных микроскопов значительно возросла, а примененное Хендерсеном быстрое замораживание образцов жидким азотом позволило сохранить структуру молекул и защитить их от повреждений потоком электронов. И в 1990 году группа Хендерсона опубликовала в журнале Journal of Molecular Biology работу, где трехмерная структура бактериородопсина была представлена в высоком разрешении.

Структура бактериородопсина, полученная Хендерсоном и его сотрудниками в 1990 году

Но успех в исследованиях бактериородопсина был связан с тем, что этот белок естественным образом накапливается в клеточных мембранах, а его молекулы при этом одинаково ориентированы в пространстве. Как быть с другими белками, распределенными в цитоплазме случайным образом?

Над этой проблемой с 1970-х годов работал в Нью-Йорке Иоахим Франк. Он создал компьютерный алгоритм, позволяющий различить в полученном при помощи электронного микроскопа изображении следу белковых молекул, находящихся под разными углами относительно потока электронов. Анализируя множество изображений, компьютер объединял аналогичные снимки и получал усредненное изображение с большей точностью. Затем Франк занялся другим алгоритмом, предназначенным для построения трехмерного изображения молекулы на основе двухмерных изображений под разными углами. В целом от появления идея до первых результатов у Франка ушло более десяти лет, с середины 1970-х до середины 1980-х, когда он применил свой метод для построения модели поверхности рибосомы. В дальнейшем Франк посвятил много времени изучению рибосом различных организмов при помощи криоэлектронной микроскопии и, в частности, сумел описать движение субъединиц рибосом относительно друг друга.

В те же годы Жак Дюбоше работал в Европейской лаборатория молекулярной биологии в Гейдельберге, пытаясь решить проблему высыхания и повреждения в вакууме исследуемых на электронном микроскопе образцов. Именно Дюбоше решил применить для этого сверхбыстрое охлаждение. Дело в том, что если обычно вода при охлаждении кристаллизуется, и это, в частности, разрушает тонкие клеточные структуры, то при очень быстром охлаждении вода не превращается в лед, а переходит в стеклообразное состояние. Она становится твердой, но сохраняет свойства жидкости. Такой процесс называется витрификацией.

Считалось, что витрификация воды невозможна, но Дюбоше со своими коллегами начал ставить эксперименты, пытаясь витрифицировать крошечные капельки воды охлаждая их жидким азотом при температуре –196 °С. Успеха удалось добиться только перейдя от жидкого азота к этану. Исследователи увидели под микроскопом аморфную структуру, но сначала подумали, что перед ними капелька жидкого этана. Однако в этот момент капелька слегка нагрелась и ее молекулы перегруппировались, образовав хорошо знакомый рисунок кристалла водяного льда.

Вскоре после этого Жак Дюбоше и его коллеги разработали технику охлаждения, которая стала широко применяться в криоэлектронной микроскопии. Они растворяли образцы, например, вирусные частицы, в воде, а раствор превращали в тонкую пленку на металлической сетке. Пленка быстро охлаждается жидким этаном, вода витрифицируется. Затем образец исследуется под электронным микроскопом, а его охлажденное состояние в это время поддерживается при помощи жидкого азота.

Вирусы в витрифицированной воде. Изображение получено группой Дюбоше в 1984 году.

Криоэлектронная микроскопия, появившись в 1980-е годы, уступала по своему разрешению обычной электронной микроскопии. Когда в 1991 году Иоахим Франк объединил витрификацию Дюбоше со своим методом компьютерной обработки изображений, он добился изображения своих излюбленных рибосом с разрешением в 40 ангстрем. Это было большим достижением, но все равно давало возможность увидеть лишь контуры рибосомы, напоминавшие каплю. Поскольку криоэлектронная микроскопия создавала изображения, напоминающие пузыри, она получила ироничное прозвище «блобология» (blobology). Но Ричард Хендерсон, который верил в перспективность этого метода, упорно работал над оптимизацией электронных микроскопов, стремясь получить изображения с точностью до отдельного атома. Прорыв произошел в 2013 году, когда появился новый тип электронного детектора (Direct Electron Detector).

Структура сложной белковой молекулы глутамата дегидрогеназы, показанная методами, существовавшими до 2013 года и после.

Сейчас криоэлектронная микроскопия используется все чаще. Быстрая витрификация позволяет замораживать белки на отдельных стадиях биохимических процессов, получая в итоге серии изображений, из которых создаются “фильмы”, демонстрирующие, как белки движутся и взаимодействуют с другими молекулами. Методы криоэлектронной микроскопии дают ученым трехмерные изображения с разрешением в 3,4 – 3,8 ангстрем. Используя их, ученые определили точную структуру и механизм работы множества белков, а также сделали немало других открытий.

С помощью криоэлектронной микроскопии, например, в 2015 году были установлены детали строения миторибосом (митохондриальных рибосом), что дало возможность обнаружить их отличия как от цитоплазматических рибосом, так и от рибосом бактерий. В том же году группа ученых из Национального института рака и Национального института сердца, легких и крови (США) под руководством Фрэнсиса Коллинза представила снимок молекулы структура белка β-галактозидазы. Ученые использовали около 40 000 отдельных изображений, чтобы получить окончательный вид структуры молекулы. В результате они достигли рекордного разрешения в 0,22 нанометра (2,2 ангстрема). В 2016 году с помощью криоэлектронной микроскопии была изучена структура вируса Зика.

Источник: Полная лента ПОЛИТ.РУ – Разглядеть замороженные молекулы